"МР 4.2.0327-23. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Молекулярное типирование энтеровирусов. Методические рекомендации"
(утв. Роспотребнадзором 06.06.2023)

1. Разработаны ФБУН "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Роспотребнадзора (Л.Н. Голицына, С.Г. Селиванова, В.В. Зверев, Н.В. Пономарева, Н.А. Новикова).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 6 июня 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические рекомендации (далее - МР) определяют алгоритм проведения молекулярного типирования энтеровирусов способом частичного секвенирования области VP1 генома.

1.2. Молекулярное типирование с использованием амплификации и секвенирования нуклеотидных последовательностей региона VP1 является прямым методом идентификации серотипа энтеровируса, обладает высокими показателями специфичности.

На основании молекулярно-биологических свойств энтеровирусы разделены на 4 вида, включающие вирусы более 100 серотипов (приложение 1 к настоящим МР): Enterovirus A, Enterovirus B, Enterovirus C, Enterovirus D (приложение 1 к настоящим МР). К виду Enterovirus C относятся полиовирусы 3 типов <1>. Наибольшее количество случаев заболеваний энтеровирусной инфекцией связано с вирусами видов Enterovirus A и Enterovirus B.

--------------------------------

<1> Официальный сайт группы изучения пикорнавирусов Института профилактики и контроля вирусных заболеваний: www.picornaviridae.com (в свободном доступе).

Тип энтеровируса определяется с использованием молекулярного типирования, которое основано на определении нуклеотидной последовательности области генома, кодирующей капсидный белок VP1. Полипептид VP1 содержит аминокислотные последовательности, определяющие серотип вируса.

1.3. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами научно-исследовательских и медицинских организаций.

2.1. Метод молекулярного типирования энтеровирусов применяется при осуществлении эпидемиологического надзора за энтеровирусной инфекцией, в том числе для проведения:

- мониторинга циркуляции энтеровирусов разных типов;

- расследования вспышек энтеровирусной инфекции;

- расследования атипичных, тяжелых и летальных случаев энтеровирусной инфекции.

2.2. Для проведения метода молекулярного типирования энтеровирусов необходимы условия для работы с возбудителями III группы патогенности и материалом, инфицированным или потенциально инфицированным диким полиовирусом <2>.

--------------------------------

<2> Главы IV, XXXII СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 N 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный N 67587); от 25.05.2022 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный N 68934) (далее - СанПиН 3.3686-21).

3.1. Организация рабочих помещений и техника безопасности при работе с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней, а также с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом, осуществляются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <3>, а также методическими документами <4>.

--------------------------------

<3> Главы IV, XXXII СанПиН 3.3686-21.

<4> МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009 (далее - МУ 1.3.2569-09).

4.1. Настоящими МР рекомендуется применять оборудование, расходные материалы, питательные среды, реагенты и реактивы, приведенные в приложении 2.

5.1. Для определения типа энтеровируса исследуются:

- нативные и пассированные в культуре ткани пробы клинического материала и объектов окружающей среды, в которых обнаружены энтеровирусы;

- нетипирующиеся ЦПА, выделенные от больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и из объектов окружающей среды;

- энтеровирусы, выделенные и типированные в реакции нейтрализации в культуре ткани.

5.2. Для проведения молекулярного типирования энтеровирусов используются следующие образцы материала: положительные на присутствие энтеровирусов суспензии фекалий, спинномозговая жидкость, мазки из ротоглотки, носо/ротоглоточные смывы, мокрота, содержимое везикул, секционный материал, концентраты проб воды; культуральная жидкость пассированных образцов (содержащая неполиомиелитные энтеровирусы или нетипируемые ЦПА). В качестве исходного материала могут быть использованы препараты РНК, экстрагированные из перечисленных образцов (в случае, если с момента экстракции прошло не более 24 часов, препарат хранят при температуре плюс 4 °C, замораживание не допускается), или кДНК (допускается хранение препарата кДНК при температуре плюс 4 °C, замораживание не рекомендуется).

5.3. Сбор, обработку, упаковку, хранение и транспортировку материала осуществляют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <5>, а также методическими документами <6>.

--------------------------------

<5> Глава IV СанПиН 3.3686-21.

<6> МУ 4.2.2039-05 "Техника сбора и транспортирования биологических материалов в микробиологическую лабораторию", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 23.12.2005.

При проведении молекулярно-генетических исследований используются стерильные наконечники для микропипеток и микропробирки, все операции проводятся в одноразовых перчатках, защитных очках. При работе с исходными образцами и материалом, содержащим нуклеиновые кислоты, применяются наконечники с аэрозольным барьером.

6.1. Порядок проведения исследований.

Определение типа энтеровирусов проводится путем анализа области VP1 генома, включающего:

- выделение РНК;

- постановку реакции обратной транскрипции;

- дифференциальную амплификацию фрагмента кДНК с праймерами, специфичными в отношении видов Enterovirus A и Enterovirus B (приложение 3 к настоящим МР);

- в случае отрицательного результата видоспецифичной амплификации проводят реакцию с праймерами, универсальными для видов Enterovirus A - D;

- очистку фрагмента кДНК;

- мечение фрагмента кДНК;

- очистку меченого фрагмента кДНК;

- определение нуклеотидной последовательности фрагмента кДНК в автоматическом режиме;

- определение типа энтеровируса методом сравнения полученной последовательности с последовательностями энтеровирусов, представленными в международной базе нуклеотидных последовательностей <7>.

--------------------------------

<7> Официальный сайт идентификации нуклеотидных и белковых последовательностей - blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (в свободном доступе).

На стадиях выделения РНК, постановки обратной транскрипции и амплификации кДНК рекомендуется введение отрицательного контроля.

6.2. Выделение РНК.

Проводят согласно инструкции по применению комплектов реагентов для выделения РНК.

6.3. Реакция обратной транскрипции.

Реакцию проводят в 20 мкл непосредственно после получения РНК пробы. Реагенты:

- ревертаза (M-MLV-обратная транскриптаза 200 ед./мкл) с 5-кратным ОТ-буфером, ингибитор РНКаз 20 ед./мкл, раствор дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ОТ, ТЕ-буфер; или комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК;

- праймеры AN32, AN33, AN34, AN35.

Порядок проведения работы:

- приготовить смесь праймеров - указанные праймеры с концентрацией 20 пкмоль/мкл смешать в отдельной пробирке в равных объемах;

- в промаркированные амплификационные пробирки внести по 1 мкл смеси праймеров AN32 - 35 (конечная концентрация 2 пкмоль/мкл каждого);

- индивидуальными наконечниками с фильтром внести по 10,2 мкл исследуемых проб, кратко центрифугировать;

- инкубировать при 65 °C в течение 1 мин;

- используя только индивидуальные для каждого реагента наконечники, в отдельной пробирке приготовить реакционную смесь для анализа необходимого числа проб (табл. 1), смесь перемешать;

- в пробирки с пробами внести по 8,8 мкл реакционной смеси, кратко центрифугировать;

- инкубировать по программе: 42 °C - 30 мин; 95 °C - 5 мин;

- в каждую пробирку внести по 20 мкл ТЕ-буфера, кратко центрифугировать.

По 5 мкл полученной кДНК перенести в промаркированные пробирки отдельно для каждого способа амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов. Оставшуюся часть кДНК - хранить при температуре плюс 4 °C.

6.4. Амплификация фрагментов кДНК области VP1 генома энтеровирусов.

Реагенты:

- Taq ДНК-полимераза 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl₂; модифицированная Taq ДНК-полимераза для постановки ПЦР с "отложенным стартом" 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl₂; готовая смесь дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ПЦР; ДМСО; деионизованная вода, свободная от РНКаз; или наборы реагентов для постановки ПЦР;

- праймеры: для дифференциальной и универсальной амплификации области VP1 генома энтеровирусов методом двухраундовой ПЦР используют комбинации праймеров (табл. 2).

Амплификацию кДНК с праймерами, специфичными в отношении вирусов видов Enterovirus A и Enterovirus B или универсальными для Enterovirus A - D, проводят отдельно в разных пробирках в 2 раунда.

6.4.1. Первый раунд ПЦР.

Реакцию проводят в 15 мкл смеси. Порядок проведения работы:

- приготовить смесь праймеров для 1-го раунда ПЦР (в отдельных пробирках смешать необходимые праймеры с концентрацией 20 пкмоль/мкл в равных объемах (табл. 3));

- отдельно для каждого способа амплификации приготовить необходимое количество реакционной смеси (табл. 3);

- в амплификационные пробирки, содержащие по 5 мкл кДНК, внести по 10 мкл реакционной смеси, кратко центрифугировать;

- инкубировать в амплификаторе по программе для 1-го раунда ПЦР области VP1 генома:

[95 °C - 1 мин (95 °C - 20 сек; 42 °C - 20 сек; 60 °C - 20 сек) x 40 циклов, 60 °C - 5 мин] <8>.

--------------------------------

<8> Примечание: не допускается электрофоретическая детекция продукта первого раунда ПЦР перед постановкой второго раунда.

6.4.2. Второй раунд ПЦР.

Реакцию проводят в 30 мкл смеси. Порядок проведения работы:

- приготовить смесь праймеров для 2-го раунда ПЦР (в отдельных пробирках смешать необходимые праймеры с концентрацией 20 пкмоль/мкл в равных объемах (табл. 3));

- отдельно для каждого способа амплификации приготовить необходимое количество реакционной смеси (табл. 4);

- в промаркированные амплификационные пробирки, содержащие по 25 мкл реакционной смеси, внести по 5 мкл амплификата 1 раунда ПЦР, кратко центрифугировать;

- инкубировать в амплификаторе по программе для 2-го раунда ПЦР области VP1 генома:

[95 °C - 15 мин (95 °C - 10 сек; 60 °C - 10 сек; 72 °C - 10 сек) x 42 цикла, 72 °C - 5 мин].

В результате ПЦР области VP1 генома синтезируют продукт размером 375 п.н., который визуализируют методом электрофореза в 1,5%-м агарозном геле. При постановке проверочного электрофореза в лунку наносят 5 мкл амплификата. Электрофорез проводится при напряжении 150 В в течение 15 - 20 мин.

6.5. Очистка полученных фрагментов ДНК для секвенирования.

Для очистки используют весь оставшийся объем амплификата (25 мкл). Очистку проводят из амплификата (если отсутствуют фрагменты ДНК неспецифичного размера) или агарозного геля (если в результате электрофореза наряду со специфичным продуктом визуализируются фрагменты ДНК неспецифичного размера) с использованием соответствующих наборов выделения ДНК для молекулярно-генетических исследований. Концентрацию очищенной ДНК определяют методом электрофореза относительно концентрационного стандарта или на спектрофотометре при длине волны 280 нм.

6.6. Секвенирование кДНК энтеровирусов в автоматическом режиме.

Набор реагентов для мечения ДНК выбирают в зависимости от модели используемого секвенатора, реакцию проводят согласно инструкции по применению. В случае использования капиллярных секвенаторов мечение фрагментов кДНК энтеровирусов проводят с использованием праймеров AN232 и AN233 или AN233m в соответствии со способом амплификации (табл. 2).

Очистку меченой ДНК и секвенирование в автоматическом режиме осуществляют в соответствии с протоколом производителя.

Меченые и очищенные фрагменты ДНК секвенируют в автоматическом режиме.

В случае использования капиллярных секвенаторов устанавливают нуклеотидные последовательности двух цепей фрагментов кДНК. При успешном секвенировании хроматограмма не имеет посторонних сигналов и читается до позиции, соответствующей длине анализируемого фрагмента ДНК (пики примерно одинаковой высоты). Для обеспечения достоверности филогенетического анализа каждый нуклеотид прочитывают по одному разу в каждом из направлений.

Установленную нуклеотидную последовательность идентифицируют методом сравнения с имеющимися в международной базе нуклеотидными последовательностями энтеровирусов с использованием программного обеспечения <9>. Принадлежность нуклеотидной последовательности фрагмента кДНК области VP1 генома энтеровируса того или иного типа определяют на основании уровня гомологии со сравниваемой последовательностью типового референтного штамма не менее 75,0%.

--------------------------------

<9> Официальный сайт идентификации нуклеотидных и белковых последовательностей blast.ncbi.nlm.nih.gov (в свободном доступе). Примечание: допускается использование аналогичных или с лучшими характеристиками программных средств для сравнения установленной нуклеотидной последовательности.

6.7. Результаты молекулярного типирования энтеровирусов загружаются в федеральную государственную информационную систему сведений санитарно-эпидемиологического характера (ФГИС СЭХ) <10>.

--------------------------------

<10> Постановление Правительства Российской Федерации от 02.12.2021 N 2178 "Об утверждении Положения о федеральной государственной информационной системе сведений санитарно-эпидемиологического характера".

6.8. Интерпретация результатов.

Типирование энтеровирусов с использованием амплификации и секвенирования нуклеотидных последовательностей VP1 региона является прямым методом и характеризуется высокой специфичностью. Установленный с использованием данного метода тип вируса соответствует типу, определяемому в реакции нейтрализации с использованием набора гипериммунных сывороток. Если гомология установленной последовательности ни с одной из представленных последовательностей энтеровирусов известных типов не превышает 75,0%, то предполагают выявление энтеровируса нового типа. Образцы, содержащие изоляты, соответствующие данным критериям, направляются для дальнейшего изучения в референс-центр по мониторингу за энтеровирусными инфекциями ФБУН "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Роспотребнадзора <11>, а также могут быть направлены в подведомственные организации Роспотребнадзора <12>.

--------------------------------

<11> Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации".

<12> Дальневосточный региональный научно-методический центр по изучению энтеровирусных инфекций ФБУН ХНИИЭМ Роспотребнадзора; Урало-Сибирский региональный научно-методический центр по изучению энтеровирусных инфекций ФБУН ФНИИВИ "Виром" Роспотребнадзора.

6.9. Эффективность метода.

Данный алгоритм молекулярного типирования энтеровирусов был испытан на панели, содержащей 100 энтеровирус-положительных образцов. Тип энтеровируса установлен в 96% случаев. Включение в алгоритм исследований способа дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома вирусов видов Enterovirus A и Enterovirus B, в дополнение к способу универсальной амплификации генома энтеровирус видов Enterovirus A - D, повышает эффективность молекулярного типирования на 46,97%.

--------------------------------

<13> Официальный сайт группы изучения пикорнавирусов Института профилактики и контроля вирусных заболеваний www.picornaviridae.com (в свободном доступе).

--------------------------------

<14> Примечание: допускается применение оборудования, расходных материалов, питательных сред, реагентов и реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

1. Материально-техническое обеспечение:

- стандартное оборудование для ПЦР-лаборатории <15> (дополнительно для постановки 2-го раунда ПЦР отдельный ПЦР-бокс и набор автоматических дозаторов);

- стандартное оборудование для секвенирования ДНК <10> (перечень оборудования, необходимого для проведения секвенирования продуктов амплификации, определяется в соответствии с инструкциями по эксплуатации производителей автоматических секвенаторов (например, капиллярные секвенаторы, приборы для нанопорового секвенирования));

- компьютер с выходом в информационно-коммуникационную сеть Интернет.

--------------------------------

<15> МУ 1.3.2569-09.

2. Реагенты и тест-системы, зарегистрированные на территории Российской Федерации <16>:

- для выделения РНК: наборы реагентов для выделения РНК;

- для постановки обратной транскрипции: ревертаза (M-MLV обратная транскриптаза 200 ед./мкл), 5-кратный ОТ-буфер, готовая смесь дНТФ с концентрацией 2,5 мМ, ингибитор РНКаз 20 ед./мкл, ТЕ-буфер; или комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК;

- для постановки ПЦР: Taq ДНК-полимераза 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl₂; химически модифицированная Taq ДНК-полимераза для постановки ПЦР с "отложенным стартом" 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl₂; готовая смесь дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ПЦР; деионизованная вода, свободная от РНКаз; диметилсульфоксид (далее - ДМСО); или комплект реагентов для постановки ПЦР;

- маркер длины фрагментов ДНК в диапазоне 100 - 1000 п.н.;

- олигонуклеотидные праймеры (рабочая концентрация праймеров амплификации в агарозном геле);

- наборы реагентов для очистки ДНК, предназначенные для выделения ДНК из агарозного геля или из реакционных смесей;

- реагенты для мечения очищенной кДНК (приобретаются в зависимости от модели используемого секвенатора).

--------------------------------

<16> Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий"; приказ Минздрава России от 06.06.2012 N 4н "Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий" (зарегистрирован Минюстом России 09.07.2012, регистрационный N 24852).

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий".

3. Постановление Правительства Российской Федерации от 02.12.2021 N 2178 "Об утверждении Положения о федеральной государственной информационной системе сведений санитарно-эпидемиологического характера".

4. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".

5. Приказ Минздрава России от 06.06.2012 N 4н "Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий".

6. Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации".

7. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности".

8. МУ 4.2.2039-05 "Техника сбора и транспортирования биологических материалов в микробиологическую лабораторию".

9. МУ 3.1.1.2363-08 "Эпидемиологический надзор и профилактика энтеровирусной (неполио) инфекции".

1. Патент N 2743352 Российская Федерация. Способ дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов видов Enterovirus A и Enterovirus B: N 2020117726: заявл. 19.05.2020: опубл. 17.02.2021 / Голицына Л.Н.; правообладатель ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора // Бюллетень ФИПС "Изобретения. Полезные модели". 2021. N 5. 17.02.2021.

2. Nix W.A., Oberste M.S., Pallansch M.A. Sensitive, seminested PCR amplification of VP1 sequences for direct identification of all enterovirus serotypes from original clinical specimens // J. Clin. Microbiol. 2006. Vol. 44. P. 2698 - 2704.

3. Oberste M.S., Maher K., Williams A.J., Dybdahl-Sissoko N., Brown B.A., Gookin M.S., S., Mishrik N., Uddin M., Pallansch M.A. Species-specific RT-PCR amplification of human enteroviruses: a tool for rapid species identification of uncharacterized enteroviruses // J. Gen. Virol. 2006. Vol. 87 (Pt 1). P. 119 - 128.