"МУК 4.1.3937-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств тетранилипрола и его основного метаболита BCS-CL73507-N-метил-хиназолинона (BCS-CQ63359) в плодоовощной и соковой продукции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 03.07.2023)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (Кузьмин С.В., Ракитский В.Н., Федорова Н.Е., Гречина М.С., Белицкая В.В.).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой "03" июля 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием для определения массовой концентрации тетранилипрола в плодах и соке плодовых семечковых (яблоки, груши) и плодовых косточковых (вишня, черешня, слива), тетранилипрола с учетом основного метаболита BCS-CL73507-N-метил-хиназолинона (BCS-CQ63359) в ягодах и соке винограда, картофеле, в плодах и соке томатов, капусте в диапазоне (0,01 - 0,50) мг/кг без учета разбавления, (0,01 - 25,00) мг/кг с учетом разбавления в 50 раз.

1.2. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Тетранилипрол - 1-(3-хлорпиридин-2-ил)-N-[4-циано-2-метил-6-(метилкарбамоил)фенил]-3-{[5-(трифторметил)-2H-тетразол-2-ил]метил}-1H-пиразол-5-карбоксамид <1>. Брутто-формула C₂₂H₁₆ClF₃N₁₀O₂. Молекулярная масса 544,9 г/моль.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

2.2. Физические и химические свойства. Порошок светло-желтого цвета без выраженного запаха. Давление паров 3,2·10^-6 Па (при плюс 20 °C). Растворимость в воде 1,2 мг/дм³ (при плюс 25 °C), 1 мг/дм³ (при pH = 4), 1,3 мг/дм³ (при pH = 9). Растворимость в органических растворителях (в г/дм³ при плюс 20 °C): н-гептан << 0,001, толуол - 0,17, дихлорметан - 5,3, этилацетат - 6,4, метанол - 2,9, ацетон - 21,8, диметилсульфоксид > 280. Коэффициент распределения н-октанол/вода при 25 °C: при pH = 4 - 398, при pH = 7 - 398, при pH = 9 - 79. Температура плавления плюс (227 - 230) °C. Плотность 1,52 г/см³.

2.3. Острая пероральная токсичность для крыс (ЛД₅₀) > 2000 мг/кг, острая дермальная токсичность (ЛД₅₀) > 2000 мг/кг. Острая ингаляционная токсичность (ЛК₅₀) для крыс более 5010 мг/м³ воздуха (4 часа).

2.4. Инсектицид. используется для защиты от плодовых мотыльков, листоверток и других вредителей яблок, груш, винограда и косточковых культур.

2.5. BCS-CQ63359 - 2-[1-(3-хлорпиридин-2-ил)-3-{[5-трифторметил-2H-тетразол-2-ил]метил}-1H-пиразол-5-ил]-3,8-диметил-4-оксо-3,4 дигидрохиназолин-6-карбонитрил <1>. Брутто-формула C₂₂H₁₄ClF₃N₁₀O. Молекулярная масса 526,9 г/моль. Метаболит тетранилипрола.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Измерения концентраций тетранилипрола и его метаболита BCS-CQ63359 выполняют методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

4.2. Экстракцию веществ из анализируемых проб растительной продукции и сока выполняют смесью ацетонитрила с водой (4:1). Дополнительно проводят очистку экстрактов с помощью мембранного шприцевого фильтра с размером пор не более 0,20 мкм.

4.3. Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы - 5 пг.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в таблицах 5.1 - 5.3.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментальное соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (15 - 30) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией на прибор.

8.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: подготовка подвижной фазы, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, отбор и подготовка проб.

8.2. Приготовление 0,1%-ного раствора муравьиной кислоты в воде (компонент А подвижной фазы).

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ деионизированной воды, вносят 1,0 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают. При необходимости приготовленный раствор дегазируют.

8.3. Приготовление 0,1%-ного раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле (компонент Б подвижной фазы). В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, вносят 1,0 см³ муравьиной кислоты, доводят до метки ацетонитрилом, перемешивают. При необходимости приготовленный раствор дегазируют.

Каждый компонент подвижной фазы хранят в темном месте (в стеклянных бутылях) не более 14-ти дней.

8.4. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ.

Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 8.2 и 8.3, в соотношении 1:1) при скорости подачи растворителя 0,3 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

8.5. Приготовление смеси растворителей для экстракции и приготовления рабочих растворов.

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают с помощью мерного цилиндра 800 см³ ацетонитрила, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают. Раствор хранят в герметично закрытой стеклянной емкости не более 14-ти дней.

8.6. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.

8.6.1. Исходный раствор тетранилипрола и его метаболита BCS-CQ63359 для градуировки (концентрация 100 мкг/см³).

В две мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают раздельно по (0,0100 +/- 0,0005) г тетранилипрола и BCS-CQ63359, растворяют в 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Растворы хранят в герметично закрытой таре в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более 6 месяцев.

Растворы N 1 - 8 и N 1' - 8' готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

8.6.2. Раствор N 1 тетранилипрола и раствор N 1' метаболита BCS-CQ63359 для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³).

В две мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают раздельно по 10 см³ исходных растворов тетранилипрола и BCS-CQ63359 с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 8.6.1), разбавляют ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают. Градуировочные растворы N 1 и N 1' хранят в холодильнике в герметично закрытой таре при температуре плюс (2 - 6) °C не более месяца.

8.6.3. Раствор N 2 тетранилипрола и раствор N 2' метаболита BCS-CQ63359 для градуировки и внесения (концентрация 1 мкг/см³).

В две мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают раздельно по 10 см³ градуировочных растворов N 1 тетранилипрола и N 1' метаболита BCS-CQ63359 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 8.6.2), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают. Градуировочные растворы N 2 и N 2' хранят в холодильнике в герметично закрытой таре при температуре плюс (2 - 6) °C не более двух недель.

Растворы N 1, N 2, N 1' и N 2' используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения веществ методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

8.6.4. Рабочие растворы N 3 - 8 тетранилипрола для градуировки (концентрация 0,001 - 0,1 мкг/см³).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 10,0; 5,0; 2,5 и 1,0 см³ градуировочного раствора N 2 с концентрацией тетранилипрола 1,0 мкг/см³ (п. 8.6.3), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.5, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы NN 3 - 6 с концентрацией тетранилипрола 0,1; 0,05; 0,025 и 0,01 мкг/см³, соответственно.

В 2 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 5 и 1 см³ градуировочного раствора N 3 с концентрацией тетранилипрола 0,1 мкг/см³ (п. 8.6.4), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.5, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы NN 7, 8 с концентрацией тетранилипрола 0,005 и 0,001 мкг/см³, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более десяти дней.

8.6.5. Рабочие растворы N 3' - 8' метаболита BCS-CQ63359 для градуировки (концентрация 0,001 - 0,1 мкг/см³).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 10,0; 5,0; 2,5 и 1,0 см³ градуировочного раствора N 2' с концентрацией BCS-CQ63359 1,0 мкг/см³ (п. 8.6.3), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.5, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы NN 3' - 6' с концентрацией метаболита BCS-CQ63359 0,1; 0,05; 0,025 и 0,01 мкг/см³, соответственно.

В 2 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 5 и 1 см³ градуировочного раствора N 3' с концентрацией BCS-CQ63359 0,1 мкг/см³ (п. 8.6.5), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.5, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы NN 7', 8' с концентрацией метаболита BCS-CQ63359 0,005 и 0,001 мкг/см³, соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике при температуре плюс (2 - 6) °C не более десяти дней.

8.7. Установление градуировочных характеристик.

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика от концентрации тетранилипрола и его метаболита BCS-CQ63359 в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 5 мм³ каждого градуировочного раствора (N 4 - N 8) для тетранилипрола и (N 4' - N 8') для метаболита BCS-CQ63359 и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.2. Осуществляют не менее 5-ти параллельных измерений. Устанавливают площади пиков тетранилипрола и его метаболита BCS-CQ63359.

8.8. Контроль стабильности градуировочных характеристик.

Контроль стабильности градуировочных характеристик проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

Проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание тетранилипрола и его метаболита BCS-CQ63359 в которых должно входить в диапазон концентраций от 0,001 до 0,05 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где A - величина расхождения, %;

X - концентрация тетранилипрола или его метаболита BCS-CQ63359 в растворе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 20% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 20%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов тетранилипрола и его метаболита BCS-CQ63359, предусмотренных МИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 8.7.

9.1. Отбор проб осуществляется в соответствии с методическими документами <2>.

--------------------------------

<2> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79, ГОСТ 34314 "Межгосударственный стандарт. Яблоки свежие, реализуемые в розничной торговле. Технические условия", ГОСТ 33499 "Межгосударственный стандарт. Груши свежие. Технические условия", ГОСТ 33801 "Межгосударственный стандарт. Вишня и черешня свежие. Технические условия", ГОСТ 32286 "Межгосударственный стандарт. Сливы, реализуемые в розничной торговле. Технические условия", ГОСТ 32786 "Межгосударственный стандарт. Виноград столовый свежий. Технические условия", ГОСТ 7176 "Межгосударственный стандарт. Картофель продовольственный. Технические условия", ГОСТ 34298 "Межгосударственный стандарт. Томаты свежие. Технические условия", ГОСТ Р 51809 "Государственный стандарт Российской Федерации. Капуста белокочанная свежая, реализуемая в розничной торговой сети. Технические условия".

9.2. Растительные пробы и сок хранят при температуре плюс (2 - 6) °C не более недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C. Перед анализом растительные образцы измельчают. Перед измельчением плоды косточковых культур освобождают от косточек.

10.1. Экстракция.

Образец растительной продукции или сока массой 2 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см³ и заливают 20 см³ смеси, приготовленной по п. 8.5. Затем помещают на аппарат для встряхивания на 15 минут, следя за равномерностью перемешивания по всему объему пробы. После встряхивания пробу центрифугируют в течение 3 мин при скорости вращения 4000 оборотов/мин. Часть надосадочной жидкости фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,20 мкм) в виалу и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.2.

10.2. Измерения выполняют на жидкостном хроматографе с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации электроспрей (ESI) при следующих режимных параметрах:

- электростатическое напряжение плюс 5000 В;

- полярность: положительная;

- режим работы: мониторинг множественных реакций (MRM).

Параметры масс-спектрометрического детектора:

- материнский ион (масса/заряд): 545,12;

- дочерние ионы (масса/заряд): 356 (количественный расчет), 376,1;

- напряжение на фрагментаторе, В: 114;

- энергия разрушения (соударения), В: , .

- материнский ион (масса/заряд): 527;

- дочерние ионы (масса/заряд): 389 (количественный расчет), 247,9;

- напряжение на фрагментаторе, В: 134;

- энергия разрушения (соударения), В: , .

Скорость сканирования: 200 мс.

Давление на распылителе: 35 psi.

Скорость газа распыления (азот): 10 дм³/мин.

Скорость осушающего газа (азот): 12 дм³/мин.

Температура осушающего газа: плюс 400 °C.

Условия хроматографирования:

- хроматографическая колонка стальная, длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм;

- температура колонки плюс 40 °C;

- скорость потока элюента 0,3 см³/мин;

- объем вводимой пробы 5 мм³;

- подвижная фаза: 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде - 0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле (30:70, по объему).

Линейный диапазон детектирования 5 - 250 пг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 0,05 мкг/см³, разбавляют смесью растворителей, приготовленной по п. 8.5 (не более чем в 50 раз).

11.1. Содержание тетранилипрола и его метаболита BCS-CQ63359 в пробах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где C - концентрация вещества, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстрагента, см³ (20 см³);

m - масса анализируемого образца, г (2 г);

Кр - коэффициент разбавления (если экстракт подвергался разбавлению).

Идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

11.2. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (таблица 3.1), при этом .

При невыполнении условия (3) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12.1. Результат количественного анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг.

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности по диапазону концентраций, таблица 3.1), %.

Результат измерений должен иметь тот же десятичный разряд, что и погрешность.

Если содержание вещества менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: содержание тетранилипрола и его метаболита BCS-CQ63359 - менее 0,01 мг/кг <3>.

--------------------------------

<3> 0,01 мг/кг - предел обнаружения тетранилипрола и его метаболита BCS-CQ63359.

13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6). Периодичность и формы контроля определяется руководством по качеству.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Межгосударственный стандарт. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

3. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

4. ГОСТ 29227 "Межгосударственный стандарт. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

5. ГОСТ 1770 "Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

6. ГОСТ OIML R 111-1 "Межгосударственный стандарт. Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования".

7. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

8. ГОСТ 5848 "Государственный стандарт союза ССР. Реактивы. Кислота муравьиная".

9. ГОСТ 25336 "Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

10. ГОСТ 26678. "Государственный стандарт союза ССР. Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия (с Изменением N 1)".

11. ГОСТ 12.1.007 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

12. ГОСТ 12.1.019 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".

13. ГОСТ 12.1.004 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

14. ГОСТ 12.4.009 "Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

15. ГОСТ ISO 7886-1 "Межгосударственный стандарт. Шприцы инъекционные для однократного применения стерильные".

16. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 N 2051-79.

17. ГОСТ 34314 "Межгосударственный стандарт. Яблоки свежие, реализуемые в розничной торговле. Технические условия".

18. ГОСТ 33499 "Межгосударственный стандарт. Груши свежие. Технические условия".

19. ГОСТ 33801 "Межгосударственный стандарт. Вишня и черешня свежие. Технические условия".

20. ГОСТ 32286 "Межгосударственный стандарт. Сливы, реализуемые в розничной торговле. Технические условия".

21. ГОСТ 32786 "Межгосударственный стандарт. Виноград столовый свежий. Технические условия".

22. ГОСТ 7176 "Межгосударственный стандарт. Картофель продовольственный. Технические условия".

23. ГОСТ 34298 "Межгосударственный стандарт. Томаты свежие. Технические условия".

24. ГОСТ Р 51809 "Государственный стандарт Российской Федерации. Капуста белокочанная свежая, реализуемая в розничной торговой сети. Технические условия".