"РД 52.18.668-2005. Руководящий документ. Методические указания. Определение массовой доли индивидуальных конгенеров полихлорбифенилов в пробах биоматериала. Методика выполнения измерений методом капиллярной газожидкостной хроматографии"
(утв. Росгидрометом 12.12.2005)

1.1 Настоящие методические указания устанавливают методику выполнения измерений (МВИ) массовой доли индивидуальных конгенеров (далее - конгенеры) полихлорбифенилов (ПХБ) (дихлорбифенилов, трихлорбифенилов, тетрахлорбифенилов, пентахлорбифенилов, гексахлорбифенилов, гептахлорбифенилов, октахлорбифенилов, нонахлорбифенилов) в пробах биоматериала в диапазоне от 0,1 до 500 мкг/кг методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с использованием капиллярной колонки.

Примечание - Верхний предел диапазона измерений может быть увеличен путем разбавления экстрактов органическими растворителями.

1.2 Настоящие методические указания предназначены для использования в лабораториях, осуществляющих наблюдения за загрязнением объектов окружающей среды остаточными количествами стойких органических загрязнений.

2.1 В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие нормативные документы:

ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

Примечание - Ссылки на остальные стандарты приведены в разделе 4.

В настоящих методических указаниях применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 проба биоматериала (далее - проба): Проба органов или тканей живых организмов.

3.2 гомогенизированная проба: Проба, измельченная до однородного состояния.

3.3 анализируемая матрица: Вещество пробы, взятой на анализ.

3.4 суррогатный стандарт: Конгенеры, раствор которых вводится в навеску пробы перед экстракцией для определения степени извлечения ПХБ.

3.5 рабочие растворы смеси ПХБ: Растворы смеси конгенеров ПХБ, которые используются при анализе экстрактов проб для расчета массовой доли анализируемых конгенеров, проверки времен удерживания и линейного диапазона детектирования.

При соблюдении всех регламентируемых МВИ условий проведения измерений характеристики погрешности результата измерений с вероятностью P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1.

4.1 При выполнении измерений массовой доли конгенеров ПХБ применяют следующие средства измерений:

- газовый хроматограф, позволяющий работать с капиллярными колонками, с инжектором splitless, с детектором по типу электронного захвата и оснащенный компьютерной системой обработки данных (далее - газовый хроматограф);

- капиллярные хроматографические колонки длиной не менее 25 м и внутренним диаметром от 0,25 до 0,32 мм с неподвижной жидкой фазой типа DB-5 или DB-1;

- микрошприцы типа Hamilton вместимостью 10 x 10^-3 см³;

- весы лабораторные высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания 510 г и пределом допустимой погрешности не более +/- 100 мг - ГОСТ 24104-2001;

- весы лабораторные специального класса точности с наибольшим пределом взвешивания 210 г и пределом допустимой погрешности не более +/- 1,0 мг - ГОСТ 24104-2001;

- цилиндры исполнения 3, вместимостью 25, 50, 100, 250 см³ - ГОСТ 1770-74;

- колбы исполнения 2, вместимостью 50, 100, 500, 1000 см³, 2 класса точности - ГОСТ 1770-74;

- пипетки типа 1, исполнения 1, 1 класса, вместимостью 2, 5, 10 см³ - ГОСТ 29227-91;

- термометр ртутный стеклянный лабораторный с диапазоном измерения от 0 °C до 150 °C с ценой деления 1 °C;

- пробирки исполнения 2 номинальной вместимостью 10 см³ - ГОСТ 1770-74.

Примечание - Допускается применение средств измерений другого типа, обеспечивающих необходимую точность измерений.

4.2 При выполнении измерений массовой доли конгенеров ПХБ применяют следующие вспомогательные устройства:

- колонки стеклянные длиной от 400 до 410 мм и внутренним диаметром (10 +/- 5) мм, оборудованные стеклянным или тефлоновым краном производства фирмы Supelco;

- колонки стеклянные длиной от 400 до 410 мм и внутренним диаметром (30 +/- 5) мм, снабженные пористым дном и резервуаром, оборудованные тефлоновым краном;

- колонки стеклянные длиной от 200 до 210 мм и внутренним диаметром (14 +/- 5) мм;

- колонки стеклянные длиной от 500 до 510 мм и внутренним диаметром (30 +/- 5) мм;

- колбы конические типа Кн исполнения 1, номинальной вместимостью 100, 250, 500 см³ - ГОСТ 25336-82;

- воронки типа ВД исполнения 1, номинальной вместимостью 25 см³, исполнения 3 номинальной вместимостью 100, 250 см³ - ГОСТ 25336-82;

- аппарат Сокслета 45/40 250 или производства фирмы Supelco;

- насадка типа НЭТФ, номинальной вместимостью 500 см³ - ГОСТ 25336-82;

- стаканы типа В исполнения 1, номинальной вместимостью 50, 100, 250, 400 см - ГОСТ 25336-82;

- стаканчики для взвешивания типа СВ (далее - бюксы) - ГОСТ 25336-82;

- воронки типа В, диаметром 36 мм, высотой 80 мм; диаметром 56 мм, высотой 80 мм; диаметром 75 мм, высотой 110 мм; диаметром 100 мм, высотой 150 мм - ГОСТ 25336-82;

- колбы типа К исполнения 1, номинальной вместимостью 250, 500 см³ - ГОСТ 25336-82;

- чашка выпарительная N 5 номинальной вместимостью 250 см³ - ГОСТ 9147-80;

- эксикатор исполнения 2, диаметром корпуса 250 мм - ГОСТ 25336-82;

- баня водяная - ТУ 64-1-2850-76;

- аппарат для встряхивания проб типа АВУ-1 - ТУ 64-1-2451-72;

- ротационный испаритель ИР-1 М2 - ТУ 25-1173.102-84;

- микроизмельчитель тканей, напряжение от 220 до 240 В, частота - 50 Гц, мощность - 300 Вт;

- шкаф сушильный с максимальной температурой нагрева 200 °C;

- плитка электрическая с закрытой спиралью мощностью 800 Вт;

- электропечь муфельная с максимальной температурой нагрева 900 °C.

Примечание - Допускается применение вспомогательных устройств другого типа, обеспечивающих необходимую точность измерений.

4.3 При выполнении измерений массовой доли конгенеров ПХБ применяют следующие материалы и реактивы:

- азот газообразный, о.с.ч. - ГОСТ 9293-74;

- ацетон о.с.ч. - ТУ-6-09-3513-86;

- н-гексан, SupraSolv производства фирмы E.Merk, каталожный номер 104371;

- изооктан, SupraSolv производства фирмы E.Merk, каталожный номер 115440;

- дихлорметан, х.ч. - ТУ 6-09-06-856-71, перегнанный;

- эфир этиловый, производства фирмы E.Merk, каталожный номер 100921;

- метанол, х.ч. - ГОСТ 6995-77;

- кислота серная, о.с.ч. - ГОСТ 4204-77;

- натрий сернокислый безводный (далее - натрий сернокислый), х.ч. - ГОСТ 4166-76;

- натрий хлористый, х.ч. - ГОСТ 4233-77;

- натрий углекислый кислый, х.ч. - ГОСТ 4201-79;

- гидроксид натрия, х.ч. - ГОСТ 4328-77;

- силикагель Kieseigel 60, 70 - 230 мкм - производства фирмы E.Merk;

- сорбент Bio-Beads S-X3 200 - 400 mesh производства фирмы Bio-Rad Laboratories;

- вода дистиллированная - ГОСТ 6709-72;

- бумага индикаторная универсальная, pH 0 - 12, производство фирмы ЛАХЕМА, Чехия;

- вата медицинская гигроскопическая - ГОСТ 5556-81, обезжиренная (промытая ацетоном и гексаном);

- волокнистый кварцевый материал - ТУ 6-11-15-191-81;

- бумага фильтровальная лабораторная - ГОСТ 12026-76;

- аттестованный раствор смеси конгенеров ПХБ в нонане BP-MS, приготовленный в соответствии с ГОСТ Р ИСО 9001-2001 с массовой долей каждого конгенера (2,0 +/- 0,2) мкг/см³, в состав которого входят следующие конгенеры (наименования конгенеров ПХБ приведены в соответствии с таблицей А.1 (Приложение А)):

1) монохлорбифенилы: # 1, 3;

2) дихлорбифенилы: # 4, 8, 10, 15;

3) трихлорбифенилы: # 18, 19, 22, 28, 33, 37;

4) тетрахлорбифенилы: # 44, 49, 52, 54, 70, 74, 77, 81;

5) пентахлорбифенилы: # 87, 95, 99, 101, 104, 105, 110, 114, 118, 119, 123, 126;

6) гексахлорбифенилы: # 128, 138, 149, 151, 153, 155, 156, 157, 158, 167, 168, 169;

7) гептахлорбифенилы: # 170, 171, 177, 178, 180, 183, 189, 191, 187, 188;

8) октахлорбифенилы: # 194, 199, 201, 202, 205;

9) нонахлорбифенилы: # 206, 208;

10) декахлорбифенил: # 209;

- конгенеры ПХБ53, ПХБ112, ПХБ166 - 35 мкг/см³ в изооктане - производства Cambridge Isotop Laboratory.

Примечание - Допускается использование реактивов и материалов другого типа, имеющих метрологические характеристики, обеспечивающие необходимую точность измерений.

5.1 Метод измерений основан на экстракции ПХБ из пробы, очистке экстракта от липидов и коэкстрактивных веществ, фракционировании экстракта и определении массовых долей анализируемых конгенеров.

5.1.1 Экстракция ПХБ из пробы проводится путем экстракции смесью органических растворителей.

5.1.2 Идентификацию конгенеров ПХБ проводят по времени удерживания, устанавливаемому с помощью градуировочного раствора, приготовленного из аттестованной смеси ПХБ.

5.1.3 Определение массовой доли конгенеров ПХБ проводят методом капиллярной газожидкостной хроматографии путем сравнения площадей пиков конгенера ПХБ в экстракте пробы и в рабочем растворе.

5.2 Минимально детектируемая масса конгенеров ПХБ в аликвоте объемом 1 мм³ составляет 0,15 пг.

6.1 Безопасность труда при проведении анализов обеспечивают в соответствии с [1], приложение Б.

6.2 При работе с вредными веществами необходимо соблюдать требования ГОСТ 12.1.007.

6.3 Оператор должен пройти инструктаж о мерах предосторожности при работе с электрическими приборами.

6.4 Помещение, где проводятся анализы, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

6.5 Сливы (отработанные растворы) органических растворителей, кислот и щелочей категорически запрещается выливать в канализацию. Сливы помещают в отдельные бутыли или пластмассовые канистры, которые хранят в соответствии с требованиями к хранению легковоспламеняющихся жидкостей и кислот, изложенными в [1].

6.6 При использовании баллонов с газами следует строго выполнять требования инструкции по безопасному их обслуживанию. Исправность контрольно-измерительных приборов и предохранительных устройств должна систематически проверяться.

7.1 К выполнению измерений допускают лиц (инженер, техник, лаборант со средним специальным образованием), прошедших соответствующую подготовку, имеющих навыки работы в химической лаборатории и ознакомленных с руководством по эксплуатации газового хроматографа.

8.1 При выполнении измерений следует соблюдать следующие условия:

9.1.1 Пробы отбираются специалистами - биологами или медиками и доставляются в лабораторию в замороженном виде.

9.1.2 Пробы хранят в морозильной камере при температуре минус (20 +/- 2) °C в тефлоновой упаковке или в стеклянных сосудах с тефлоновыми пробками. Не допускается хранить пробы в пластмассовой упаковке.

9.2.1 Приготовление рабочего раствора хлористого натрия 0,9%-ной массовой концентрации производят следующим образом:

- взвешивают в стакане 0,9 г хлористого натрия и помещают навеску в колбу вместимостью 250 см³;

- отбирают 99,1 см³ дистиллированной воды и вводят в ту же колбу;

- содержимое колбы перемешивают вращательными движениями до полного растворения навески.

9.2.2 Приготовление рабочего раствора натрия углекислого кислого массовой концентрации 10% производят следующим образом:

- взвешивают в стакане 10 г натрия углекислого кислого и помещают навеску в колбу вместимостью 250 см³;

- отбирают 90 см³ дистиллированной воды и вводят в ту же колбу;

- содержимое колбы перемешивают вращательными движениями до полного растворения навески.

9.2.3 Приготовление рабочего раствора натрия гидроксида с массовой концентрацией 1 М производят следующим образом:

- взвешивают 40 г гидроксида натрия и помещают его в мерную колбу вместимостью 1000 см³;

- добавляют в колбу дистиллированную воду и перемешивают содержимое колбы до полного растворения навески, затем объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.

9.2.4 Приготовление рабочего раствора смеси конгенеров ПХБ с массовой концентрацией 40 нг/см³ производят следующим образом:

- отбирают пипеткой 1 см³ аттестованной смеси BP-MS и помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³;

- содержимое мерной колбы доводят до метки изооктаном, тщательно перемешивая содержимое колбы;

- полученному раствору приписывают массовую концентрацию 40 нг/см³ для каждого конгенера ПХБ.

9.2.5 Приготовление рабочего раствора смеси конгенеров ПХБ с массовой концентрацией 10 нг/см³ производят следующим образом:

- отбирают пипеткой 1 см³ рабочего раствора с массовой концентрацией 40 нг/см³ и помещают в пробирку вместимостью 10 см³;

- содержимое мерной колбы доводят до 4 см³ изооктаном;

- полученному раствору приписывают массовую концентрацию 10 нг/см³.

9.2.6 Приготовление рабочего раствора смеси конгенеров ПХБ с массовой концентрацией 5 нг/см³ производят следующим образом:

- отбирают пипеткой 1 см³ рабочего раствора с массовой концентрацией 1 см³ и помещают в пробирку вместимостью 10 см³;

- к содержимому пробирки добавляют 1 см³ изооктана;

- полученному раствору приписывают массовую концентрацию 5 нг/см³.

Примечание - Допускается использование рабочих растворов смеси конгенеров ПХБ, имеющих другую массовую концентрацию.

9.2.7 Приготовление рабочих растворов конгенеров, используемых в качестве внутренних и суррогатных стандартов, производится следующим образом:

- отбирают пипеткой 0,6 см³ раствора конгенера ПХБ с массовой концентрацией 35 мкг/см³ и помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³;

- объем содержимого колбы доводят до метки изооктаном;

- полученному раствору приписывают массовую концентрацию 210 нг/см³.

9.3.1 Подготовка активированного силикагеля производится следующим образом:

- силикагель активируют в муфельной печи при температуре (350 +/- 5) °C в течение 16 ч в выпарительной чашке;

- чашку выпарительную с силикагелем накрывают алюминиевой фольгой и охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе;

- силикагель хранят в стеклянной банке с тефлоновой крышкой при комнатной температуре не более 7 сут в эксикаторе.

9.3.2 Подготовка силикагеля, импрегнированного серной кислотой, производится следующим образом:

- взвешивают в стакане 56 г активированного силикагеля и помещают его в колбу вместимостью 250 см³;

- добавляют к силикагелю 24 см³ концентрированной серной кислоты при встряхивании, смесь встряхивают до отсутствия комков.

9.3.3 Подготовка силикагеля, импрегнированного щелочью, производится следующим образом:

- взвешивают 67 г активированного силикагеля и помещают его в колбу вместимостью 250 см³;

- добавляют в колбу при встряхивании 31 см³ 1 М-ного раствора гидроксида натрия, смесь встряхивают до отсутствия видимых комков.

Очистку растворителей - гексана и дихлорметана - осуществляют путем перегонки при нормальном атмосферном давлении в соответствии с правилами перегонки органических веществ. Температуры кипения растворителей, водяной бани и собираемой фракции представлены в таблице 2.

9.5.1 Пробу вынимают из морозильной камеры и размораживают при комнатной температуре на воздухе.

9.5.2 Пробу гомогенизируют на микроизмельчителе.

Примечание - Допускается пробу измельчать с помощью мясорубки или стальным ножом, поместив ее в фарфоровую чашку.

9.5.3 Взвешивают в стакане от 5 до 20 г гомогенизированной пробы и помещают полученную навеску в выпарительную чашку.

9.5.4 К навеске пробы добавляют от 80 до 120 г безводного сульфата натрия, растирают пробу с безводным сульфатом натрия до получения однородной массы и оставляют на 2 ч при комнатной температуре.

9.5.5 К подготовленной по 9.5.4 навеске добавляют суррогатные стандарты - индивидуальные конгенеры ПХБ53 и ПХБ112 в количестве от 5 до 50 нг на навеску.

Примечание - Количество добавляемого суррогатного стандарта зависит от анализируемой матрицы, например, для проб жира - 50 нг на навеску, для проб мышц рыбы - 10 нг на навеску.

9.6.1 Экстракция методом встряхивания

9.6.1.1 К подготовленной по 9.5 навеске пробы добавляют смесь ацетон-гексан в соотношении 2:1 из расчета 3 см³ на 1 г навески и переносят полученную смесь в коническую колбу вместимостью 250 см³. Колбу закрывают стеклянной пробкой и помещают на аппарат для встряхивания. Встряхивают содержимое колбы в течение 30 мин. Затем колбу помещают в холодильник и оставляют на 1 сут.

9.6.1.2 Через 1 сут колбу вынимают из холодильника, доводят до комнатной температуры и помещают на аппарат для встряхивания. Встряхивают содержимое колбы в течение 30 мин.

9.6.1.3 Полученный по 9.6.1.2 экстракт декантируют в другую коническую колбу вместимостью 250 см³ со стеклянной пробкой. К остатку содержимого в колбе добавляют смесь гексан - этиловый эфир в соотношении 9:1 из расчета 2 см³ на 1 г навески пробы. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин.

9.6.1.4 Полученный по 9.6.1.3 экстракт декантируют, объединяя с первой порцией экстракта, полученного по 9.6.1.2. Остаток в колбе споласкивают гексаном в количестве от 2 до 3 см³, который декантируют в колбу с объединенным экстрактом, полученным по 9.6.1.2 и 9.6.1.3.

9.6.1.5 Объединенный экстракт фильтруют через бумажный фильтр в чистую коническую колбу вместимостью 250 см³ и затем переносят его в делительную воронку вместимостью 500 см³. Фильтр промывают гексаном в количестве от 2 до 3 см³ и 0,9%-ным раствором хлористого натрия из расчета 6 см³ на 1 г навески. Смывы объединяют с экстрактом в делительной воронке.

9.6.1.6 Смывы, объединенные с экстрактом в делительной воронке, встряхивают от 10 до 15 мин. После разделения слоев водную фракцию возвращают в колбу и сохраняют. Гексановый экстракт переносят в колбу ротационного растворителя, фильтруя его через безводный натрий сернокислый, помещенный на подложку из ваты.

9.6.1.7 Водную фракцию возвращают в делительную воронку, добавляют 10 см³ гексана и встряхивают от 10 до 15 мин. Гексановый экстракт добавляют к первой порции в колбе ротационного растворителя, фильтруя его через натрий сернокислый, процедуру экстракции повторяют до тех пор, пока гексановый экстракт после встряхивания не станет бесцветным.

9.6.2 Экстракция в аппарате Сокслета

9.6.2.1 Подготовленную по 9.5 навеску помещают в стаканчик аппарата Сокслета. Стаканчик устанавливают в насадке аппарата Сокслета. ПХБ экстрагируют 175 см³ гексана в течение 3 ч (от 10 до 12 циклов).

9.6.2.2 Гексановый экстракт охлаждают до комнатной температуры.

9.6.3 Колоночная экстракция

9.6.3.1 Навеску, подготовленную по 9.5, помещают в стеклянную колонку длиной (500 +/- 10) мм с внутренним диаметром (30 +/- 5) мм, имеющую в своей нижней части стеклянный фильтр и тефлоновый кран, который должен быть закрыт перед началом экстракции. Для предотвращения забивания отверстий фильтра частичками экстрагируемой матрицы на стеклянный фильтр перед внесением пробы помещают стекловолокно.

9.6.3.2 В колбу вместимостью 500 см³ помещают 300 см³ экстрагента (смесь гексан-дихлорметан в соотношении 1:1), затем обмывают экстрагентом стаканы из-под навески и полученные смывы вносят в колонку перед началом экстракции.

9.6.3.3 При открытом тефлоновом кране пропускают экстрагент через колонку со скоростью от 3 до 5 см³/мин. Скорость прохождения экстрагента через колонку регулируют тефлоновым краном. Вытекающий из колонки экстракт собирают в круглодонную колбу ротационного испарителя вместимостью 500 см³.

9.7.1 Концентрирование экстрактов, полученных по 9.6.1, 9.6.2, 9.6.3 проводят на ротационном испарителе при температуре водяной бани от 40 °C до 43 °C. Объем экстракта должен составлять от 3 до 4 см³.

9.7.1.1 При концентрировании экстрактов, полученных методом колоночной экстракции, изложенной в 9.6.3, необходимо избавиться от присутствия в экстракте дихлорметана. Для этого экстракт концентрируют до объема от 2 до 3 см³, добавляют 3 см³ гексана и продолжают концентрирование до объема от 2 до 3 см³. Полученный экстракт переносят в пробирку и уменьшают объем в токе воздуха до 0,7 см³. Добавляют 0,7 см³ гексана и уменьшают объем до 1 см³.

9.8.1 Очистку экстрактов от липидов можно проводить методом гель-фильтрации на колонках с сорбентом Bio-Beads или, при отсутствии необходимых для этого реактивов и материалов, серной кислотой.

9.8.2 Очистку гексановых экстрактов серной кислотой производят следующим образом:

- сконцентрированный гексановый экстракт переносят в пробирку и гексаном доводят объем до 4 см³;

- гексановый экстракт переносят в делительную воронку вместимостью 25 см³ и добавляют к нему от 1 до 2 см³ концентрированной серной кислоты;

- полученную в делительной воронке смесь осторожно встряхивают, после разделения слоев кислотный слой сливают и отбрасывают. Процедуру повторяют до тех пор, пока кислота после встряхивания не будет бесцветной;

- к гексановому экстракту в делительной воронке добавляют от 2 до 5 см³ 10%-ного раствора натрия углекислого кислого и смесь встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев водный слой сливают и отбрасывают. Процедуру повторяют еще 2 раза;

- к гексановому экстракту в делительной воронке добавляют от 2 до 5 см³ дистиллированной воды и смесь встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев водный слой сливают и отбрасывают. Процедуру повторяют еще 2 раза;

- гексановый экстракт переносят в пробирку вместимостью 10 см³ и концентрируют в токе азота или воздуха до объема 1 см³.

9.8.3 Для очистки экстрактов от липидов методом гель-фильтрации сконцентрированный гексановый экстракт переносят в пробирку вместимостью 10 см³, объем доводят до 2 см³ и добавляют 2 см³ дихлорметана.

9.8.3.1 Подготовка колонки для очистки экстрактов от липидов производится следующим образом:

- в стакане взвешивают 60 г сорбента Bio-Beads (далее - сорбент), помещают его в круглодонную колбу вместимостью 500 см³ и заливают смесью растворителей гексана и дихлорметана в соотношении 1:1 в количестве, необходимом, чтобы полностью покрыть сорбент для набухания и, закрыв стеклянной пробкой, оставляют на 1 сут;

- через 1 сут сорбент помещают в колонку высотой (400 +/- 10) мм и внутренним диаметром (30 +/- 5) мм, снабженную пористым дном и тефлоновым краном. Высота сорбента в колонке должна составить от 320 до 350 мм;

- для стабилизации сорбента после набивки колонки через нее пропускают 1 дм³ смеси гексан-дихлорметан в соотношении 1:1 со скоростью 5 см³/мин.

9.8.3.2 Очистку экстрактов от липидов производят следующим образом:

- перед началом работы с колонкой через нее необходимо пропустить 50 см³ смеси метанол-дихлорметан в соотношении 1:5, а затем 100 см³ смеси гексан-дихлорметан в соотношении 1:1. Полученные элюаты отбросить;

- под колонку поместить мерный цилиндр вместимостью 250 см³;

- в колбу вместимостью 500 см³ поместить 350 см³ элюента (смесь гексан-дихлорметан в соотношении 1:1);

- при открытом кране колонки внести пипеткой в колонку экстракт, полученный по 9.8.3, не нарушая поверхности сорбента. Промыть пробирку из под экстракта элюентом в объеме от 2 до 3 см³ из отмеренного количества и перенести этот элюент (далее - смыв) в колонку после прохождения через сорбент анализируемого экстракта. Процедуру повторить 6 раз. После прохождения через сорбент последней порции смыва пропустить через колонку оставшийся элюент;

- когда уровень элюата в мерном цилиндре достигнет отметки 150 см³, цилиндр следует убрать из-под колонки и заменить круглодонной колбой ротационного испарителя вместимостью 250 см³. Первая фракция элюата, собранная в мерный цилиндр и содержащая липиды, отбрасывается;

- после того, как будет собрано 100 см³ элюата, кран колонки закрывают и добавляют в колонку дополнительно 50 см³ смеси гексан-дихлорметан в соотношении 1:1 для хранения колонки;

- полученный элюат (100 см³ смеси гексан-дихлорметан) концентрируют на ротационном испарителе до объема от 2 до 3 см³, добавляют от 2 до 3 см³ гексана и продолжают концентрировать до объема от 2 до 3 см³, затем переносят в пробирку и уменьшают объем в токе воздуха до 0,7 см³. Добавляют 0,7 см³ гексана и уменьшают объем до 1 см³.

9.9.1 Дальнейшую очистку экстракта, полученного по 9.8.3.2, производят на мультислойных колонках с модифицированным силикагелем.

9.9.2 Подготовку колонки для очистки экстрактов производят следующим образом:

- в стеклянную колонку длиной (200 +/- 10) мм и внутренним диаметром (14 +/- 5) мм помещают подложку из стекловаты, на которую вносят 1 см³ натрия сернокислого безводного, 1 см³ силикагеля активированного, 3 см³ силикагеля, импрегнированного гидроксидом натрия, 1 см³ силикагеля активированного, 3 см³ силикагеля, импрегнированного серной кислотой, 1 см³ силикагеля активированного, 3 см³ силикагеля, импрегнированного серной кислотой, 1 см³ силикагеля активированного, 1 см³ натрия сернокислого безводного.

9.9.3 Очистку экстракта, полученного по 9.8.3.2, производят следующим образом:

- экстракт переносят в мультислойную колонку, пробирку из-под экстракта споласкивают двумя порциями гексана объемом от 1 до 2 см³, который также вносят в колонку. После прохождения экстракта через колонку элюируют анализируемые соединения 100 см³ гексана, собирая элюат в круглодонную колбу ротационного испарителя;

- концентрируют полученный элюат на ротационном испарителе до объема от 2 до 3 см³, переносят остаток в пробирку и уменьшают его объем в токе азота до 1 см³.

9.10.1 С целью отделения ПХБ от более полярных коэкстрактивных веществ и пестицидов, которые при анализе методом ГЖХ накладываются друг на друга, искажая аналитический сигнал, проводят очистку экстрактов на силикагеле.

9.10.2 Подготовку колонки производят следующим образом:

- в стеклянную колонку высотой (400 +/- 10) мм и внутренним диаметром от 10 до 15 мм, оборудованную тефлоновым краном, помещают подложку из стекловаты (если колонка оборудована пористым дном, подложка не нужна), при закрытом кране в колонку наливают гексан в количестве, необходимом для заполнения колонки на высоту не менее 200 мм;

- вносят в колонку активированный силикагель в количестве 8 г;

- на вершину слоя силикагеля вносят натрий сернокислый безводный высотой (10 +/- 0,5) мм;

- после заполнения колонки гексан сливают через кран и отбрасывают.

9.10.3 Очистку экстракта производят следующим образом:

- гексановый экстракт, полученный по 9.8.2 или по 9.9, переносят в колонку с силикагелем в тот момент, когда в колонке остается от 1 до 2 мм по высоте слоя гексана, используемого при заполнении колонки силикагелем;

- после переноса гексанового экстракта пробирку промывают тремя порциями гексана по 1 см³, перенося эти смывы на колонку в тот момент, когда количество растворителя в колонке будет составлять от 1 до 2 мм по высоте;

- после того, как весь гексановый экстракт пропущен через колонку, элюируют ПХБ гексаном в количестве 60 см³, собирая элюат в колбу ротационного испарителя.

9.10.4 Концентрирование полученных элюатов производят на ротационном испарителе до объема от 2 до 3 см³, остаток переносят в пробирку и уменьшают объем в токе азота или воздуха до 0,7 см³, затем добавляют 0,7 см³ изооктана. Процедуру повторяют дважды, конечный объем изооктанового экстракта доводят до объема от 0,1 до 10,0 см³. Конечный объем экстракта зависит от анализируемой матрицы, например, для проб плазмы крови конечный объем составляет 0,1 см³, для проб жира - 10 см³.

9.10.5 К сконцентрированному экстракту добавляют внутренний стандарт - конгенер ПХБ166 в количестве от 5 до 50 нг, количество добавляемого внутреннего стандарта зависит от анализируемой матрицы, например, для проб жира - 50 нг, для проб мышц - 10 нг.

9.11.1 Рабочие растворы реактивов хранят в колбах с притертыми пробками и наклеенными этикетками.

9.11.2 Рабочие растворы ПХБ хранят в холодильнике при температуре от 10 °C до 12 °C в мерных колбах с притертыми пробками не более 6 мес или в запаянных ампулах не более 12 мес.

9.11.3 Экстракты анализируемых проб хранят в холодильнике при температуре от 10 °C до 12 °C не более 40 сут.

Подготовку к работе газового хроматографа и кондиционирование хроматографической колонки проводят в соответствии с руководством по эксплуатации газового хроматографа.

10.2.1 Хроматографические измерения проводят по температурной программе, подобранной в процессе предварительных опытов таким образом, чтобы обеспечить наилучшее отделение определяемых конгенеров ПХБ от других соединений. За основу при подборе температурной программы для анализа ПХБ могут быть рекомендованы следующие условия проведения анализа:

- температура инжектора (splitless mode) - 230 °C;

- температура детектора - 350 °C;

- начальная температура термостата - 80 °C;

- скорость подъема температуры в диапазоне от 80 °C до 170 °C составляет 10 °C/мин; в диапазоне от 170 °C до 280 °C - 3,5 °C/мин, выдержка при температуре 280 °C составляет 5 мин;

- аликвота, вводимая в хроматограф - 1 мм³.

10.2.2 Для оценки фона, чистоты хроматографической системы перед началом анализа проб вводят в инжектор хроматографа аликвоту чистого растворителя и записывают хроматограмму, как указано в 10.3. При наличии на хроматограмме посторонних пиков проводят проверку хроматографической системы в соответствии с руководством по эксплуатации газового хроматографа.

10.2.3 Для проверки чистоты реактивов и материалов при анализе каждой партии проб выполняют анализ бланковой пробы, включающий все операции и реактивы, используемые в ходе анализа, за исключением анализируемой матрицы. Результаты анализа бланковой пробы учитываются при расчете массовой доли конгенеров ПХБ в пробе.

10.3.1 Шприцем отбирают аликвоту анализируемого экстракта, подготовленного по 9.10, или градуировочного раствора и вводят в инжектор газового хроматографа в режиме "splitless".

10.3.2 Хроматограмма записывается с использованием соответствующей компьютерной программы обработки результатов в виде файла.

10.3.3 Проверка базовой линии для пиков всех конгенеров ПХБ производится вручную.

10.4.1 Линейный диапазон детектирования должен быть установлен для каждого хроматографа экспериментальным путем и проверяться не менее 1 раза в год.

10.4.2 Для проверки линейности работы детектора из аттестованной смеси ПХБ готовят не менее 5 градуировочных растворов, массовая концентрация которых должна колебаться в диапазоне от 0,5 до 500 нг/см³.

10.4.3 Записывают хроматограмму каждого градуировочного раствора и с помощью программы обработки результатов рассчитывают площади пиков каждого конгенера ПХБ.

10.4.4 Для каждого градуировочного раствора определяют фактор отклика RRF_i для каждого конгенера ПХБ относительно внутреннего стандарта ПХБ 166, который рассчитывают по формуле

где i - наименование анализируемого конгенера ПХБ в соответствии с таблицей А.1 (приложение А);

m_i - масса анализируемого конгенера ПХБ в градуировочном растворе, нг;

m₁₆₆ - масса внутреннего стандарта ПХБ166, внесенного в градуировочный раствор, нг;

S_i - площадь пика анализируемого конгенера ПХБ;

S₁₆₆ - площадь пика внутреннего стандарта ПХБ166.

При наличии линейности детектирования фактор отклика RRF_i должен быть постоянным для каждого конгенера во всех градуировочных растворах, среднее квадратичное отклонение должно быть не более +/- 20%.

10.4.5 Перед началом анализа каждой новой партии проб проводится проверка линейности и постоянства факторов отклика путем хроматографирования не менее трех рабочих растворов смеси конгенеров ПХБ, приготовленных по 9.2. При отсутствии постоянства RRF_i, т.е. линейности, выясняются и устраняются причины нестабильной работы газового хроматографа.

10.5.1 Идентификация конгенеров ПХБ производится по относительным временам удерживания, которые определяются с помощью рабочего раствора смеси ПХБ, приготовленного по 9.2.4 и введенного в газовый хроматограф перед началом анализа партии анализируемых проб.

10.5.2 Расчет массы конгенера ПХБ в экстракте анализируемой пробы m_iпр, нг, проводят по формуле

где S_i - площадь пика анализируемого конгенера ПХБ;

S₁₆₆ - площадь пика внутреннего стандарта ПХБ166;

m₁₆₆ - масса внутреннего стандарта ПХБ166, внесенного в анализируемый экстракт, нг;

RRF_i - фактор отклика для анализируемого конгенера ПХБ относительно внутреннего стандарта ПХБ166.

10.5.3 Расчет массовой доли анализируемого конгенера в пробе X_i, нг/г, проводят по формуле

где m_iпр - масса анализируемого конгенера в экстракте анализируемой пробы, нг;

m_iбл - масса анализируемого конгенера в экстракте бланковой пробы, нг;

m - навеска анализируемой пробы по 9.5.3, г.

I - коэффициент извлечения суррогатного внутреннего стандарта ПХБ53 или ПХБ112, внесенного в пробу перед экстракцией, определяют по формуле

где m_{сур.обн} - масса суррогатного внутреннего стандарта, обнаруженная в экстракте анализируемой пробы, нг;

m_сур.вн - внесенная масса суррогатного внутреннего стандарта, нг.

При расчете массовой доли ди-, три- и тетрахлорбифенилов в формуле (4) используют извлечение суррогатного внутреннего стандарта ПХБ53, при расчете массовой доли пента-, гекса-, гепта-, окта-, нано- и декахлорбифенилов используют извлечение суррогатного внутреннего стандарта ПХБ112.

10.5.4. Конечный результат измерения A_i, нг/г представляют следующим образом:

где X_i - массовая доля анализируемого конгенера, рассчитанная по 10.5.3, нг/г;

- характеристика погрешности измерения, установленная в лаборатории при реализации МВИ, нг/г.

Примечание - Допускается показатели качества результатов измерения при внедрении МВИ устанавливать расчетным способом на основе выражения: . Значение определяется по таблице 1.

10.5.5 При хроматографическом анализе растворов смесей ПХБ некоторые конгенеры имеют одинаковые времена удерживания, т.е. на хроматограмме выходят в виде одного пика. Количество таких суммарных пиков зависит от типа неподвижной жидкой фазы в хроматографической колонке, длины колонки, режимов хроматографического анализа. При наличии суммарных пиков фактор отклика RRF_i+(i+1) рассчитывается для суммы этих конгенеров ПХБ, например:

где S₃₁₊₂₈ - площадь суммарного пика;

m₃₁₊₂₈ - сумма масс ПХБ31 и ПХБ28 в градуировочном растворе, нг.

Конечный результат A₃₁₊₂₈ в этом случае представляют следующим образом:

где X₃₁₊₂₈ - массовая доля суммы ПХБ31 и ПХБ28, рассчитанная по 10.5.3;

- характеристика погрешности измерения, установленная в лаборатории при реализации МВИ, нг/г.

11.1 Контроль точности результатов измерений в лаборатории предусматривает:

- оперативный контроль процедуры измерений;

- контроль стабильности результатов измерений.

11.2 Оперативный контроль процедуры измерений осуществляют на основе оценки погрешности результатов анализа при реализации отдельно взятой контрольной процедуры и сравнения полученной оценки (результата контрольной процедуры) с установленным нормативом контроля.

11.2.1 Контрольная процедура для контроля погрешности реализуется с применением метода добавок.

11.2.2 Для одной из проб берутся две навески гомогенизированной пробы: основная и контрольная. Контрольная проба маркируется индексом "К".

11.2.3 В контрольную пробу вносят добавку анализируемых конгенеров C_Д.

11.2.4 Величина добавки C_Д, нг/г, должна удовлетворять условию

где , - соответственно характеристики погрешности результатов измерений, соответствующие массовым долям анализируемых конгенеров в основной пробе и расчетному значению массовой доли анализируемого конгенера в контрольной пробе, нг/г.

11.2.5 Анализ контрольной пробы выполняют в составе партии проб в полном соответствии с настоящей МВИ.

11.2.6 Результат контрольной процедуры К_К, нг/г, рассчитывают по формуле

где X₂, X₁ - соответственно массовые доли анализируемых конгенеров в основной пробе и в контрольной пробе, нг/г.

11.2.7 Норматив контроля К, нг/г, рассчитывают по формуле

11.2.8 Проводят сопоставление результата контрольной процедуры с нормативом контроля. Если результаты контрольной процедуры удовлетворяют условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

11.2.9 При невыполнении условия (13) партия проб анализируется повторно.

11.3 Контроль стабильности результатов измерений проводят с целью подтверждения лабораторией компетентности в обеспечении качества полученных результатов анализа и оценки деятельности лаборатории в целом.

11.3.1 Контроль стабильности результатов анализа проводят с использованием контрольных карт в соответствии с [2].

11.3.2 Процедуры контроля стабильности результатов измерений регламентируются в Руководстве по качеству лаборатории, выполняющей измерения.